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Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina Rasht, Universidade de Ciências Médicas de Guilan, Rasht, (Irã)
Endereço para correspondência :
Seyed Mohammad Mohseni Mehran (PhD)
Departamento de Fisiologia, Rasht Medical School
Universidade de Ciências Médicas de Guilan, Rasht, (Irã)
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Email: mohsenimehran@gums.ac.ir
Abstrato
Antecedentes: Apesar de muitas pesquisas sobre as causas do carcinoma espinocelular de esôfago (ESCC), muitos fatores podem causar, mas alguns tipos de HPV parecem ser um desses fatores. Nos últimos estudos, o HPV causa 10 a 67% em algumas regiões. Guilan é uma região no Irã com alta incidência de (ESCC) por isso é preciso estudar mais sobre (ESCC).
Métodos: Neste estudo, nós comparamos a prevalência de 3 tipos de primers: marcadores gerais GP5 + / GP6 + para mostrar o quanto o HPV é participado, tipos oncogênicos leves de HPV 31,33,35,39,41,51,52 e risco de tipos oncogênicos de HPV 16 e 18 no gene E6 / E7 em tecidos tumorais de 45 casos de ESCC.
Resultados:Em 17 de 45 ESCC (37,7%) as amostras foram positivas para marcadores gerais, GP5 + / GP6 +, a presença de HPV foi de 4 de 45 e em relação a ESCC (8,8%) as amostras foram positivas para tipos oncogênicos e 2 do ESCC (4,4%) ) amostras foram de alto risco do gene HPV 16,18 E6 / E7 e as 22 amostras foram negativas para os tipos de HPV.
Conclusões: Nossos dados são consistidos com estudos de DNA do HPV conduzidos na área de alto risco (Guilan) para o ESCC. O HPV deve ser considerado como um fator potencial responsável pelo aumento da incidência de ESCC, apesar do baixo incidente em nosso estudo em Guilan.
Palavras-chave
Vírus do Papiloma Humano (HPV), Carcinoma de Células Escamosas do Esôfago (ESCC), Guilan
Como citar este artigo:
MOHSENI MEHRAN SM. DETECÇÃO DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO NO CARCINOMA ESQUÁGAL DE CÉLULAS ESQUAMOSAS NA PROVÍNCIA DOS GUILHÕES. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2010 abril [citado: 2018 31 de agosto]; 4: 2373-2377. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2010&month=April&volume=4&issue=2&page=2373-2377&id=708
Introdução O
câncer de esôfago é a décima neoplasia maligna mais comum no mundo, segundo após infarto cardíaco, de acordo com o último relatório do escritório regional da EMRO para a Organização do Mediterrâneo Oriental (1) , o Irã é uma das áreas com maior taxa de esôfago escamoso casos de carcinoma de células (ESCC) e norte do Irã, especialmente a província de Guilan é uma região com alta incidência. A ESCC é mais comumente originada do epitélio mucoso estratificado não-queratinizado e mostra morfologia ao carcinoma de células escamosas de outras regiões do corpo, como colo do útero e esôfago. É geralmente aceite que o tabaco, o álcool e o chá preto quente (mau hábito em algumas regiões do nordeste do Irão) e o consumo de álcool na Europa são os principais factores de risco ambientais para o desenvolvimento do ESCC.(2) .
No entanto, alguns pacientes desenvolveram ESCC mesmo sem esses 4 fatores de risco, portanto, esse fato sugere que causas adicionais, como predisposição genética, dieta ou vírus oncogênicos também podem ajudar as células a se sobrepor ou a escapar do mecanismo fisiológico de controle da proliferação.
A primeira evidência substancial que sugere uma infecção pelo HPV do esôfago foi publicada em 1982 por Syrjanen, que encontrou alterações histológicas idênticas às das lesões condilomatosas em 40% dos ESCC. A relevância da infecção por HPV pelo vírus do papiloma humano no câncer cervical e anal está bem estabelecida e por meio de analogia, os vírus HPV oncogênicos podem ter um papel na transformação maligna dos epitélios escamosos de qualquer região do corpo (3) , (4) .
O objetivo deste estudo é mostrar a prevalência do HPV na área de alto risco do ESCC na província de Guilan. O HPV é um pequeno vírus de DNA epiteliotrópico sem envelope. Seu genoma compreende 7000 a 8000 pares de bases (pb) de DNA de cadeia fechada de cadeia dupla. Mais de 120 tipos diferentes de HPV foram identificados em humanos. Alguns desses tipos de HPV, especialmente 16,18,31,33,51,52,58, parecem ter papéis específicos no desenvolvimento do câncer e, portanto, são denominados tipos oncogênicos. Alguns tipos de carcinoma de células escamosas, como o câncer cervical, são infectados principalmente por tipos de HPV oncogênicos, enquanto outras mucosas, como o esôfago, são infectadas por ampla gama de tipos de HPV com potencial tumoral variável (5) , (6) .
A presença do genoma do HPV foi relatada com várias porcentagens e padrões de genotipagem. Vários desses relatos propuseram um papel potencial para os tipos de HPV que estão associados a alto risco na transformação maligna de células-tronco da mucosa esofágica (Tabela / Fig. 1) (7) .
O efeito carcinogênico desses HPVs tem sido amplamente atribuído a 2 produtos gênicos virais E6 e E7. Foi demonstrado que a atividade de transformação dessas 2 oncoproteínas virais é pelo menos parcialmente mediada pelo aumento da quebra do supressor tumoral central do p53 e pelo aumento forma mutante e inativadora de Rb. Portanto, níveis diminuídos de p53 com expressão mais baixa ou inalterada de Rb são esperados em células transformadas por HPV (8) , (9) .
Material e métodos
Coleta de Amostras
Quarenta e nove amostras de ESCC embebidas em formol e fixadas em formol foram coletadas dos arquivos de patologia cirúrgica de 2005-2007 do Hospital Rasht Razi, Hospital Pour sina, Hospital Golsar, Laboratório de Pathobiologia Dr.Satari (Sina) e Dr.Saffari ( Fouman) laboratório de patobiologia. Os pacientes visitaram o Hospital Rasht Razi de várias partes da província e são um importante centro de doenças gastrointestinais.
Os blocos embebidos em parafina foram obtidos de cirurgia (esofagomia total ou sub-total) ou biópsia para câncer de esôfago. Primeiro, as lâminas coradas com hematoxilina e eosina prepararam-se para confirmar o ESCC e o estágio do tumor por histopatologistas especialistas, e o restante da amostra foi reexaminado para patologia molecular. Informações de idade e sexo foram registradas.
Extração de DNA
Três a cinco secções de 10 µm de espessura de cada bloco de parafina foram colocadas em tubos de microcentrífuga de 2 mL e enceradas com lavagens sequenciais de xileno (duas vezes) e absoluto e etanol a 95%. Para obter um bom extrato do bloco embebido em parafina, usamos o método Éter-Clorofórmio para obter a forma pura do DNA. Os sedimentos foram secos e digeridos durante 12 horas a 37ºC com 0,2 mg / ml de proteinase K em 10 mM de Tris-HCL, pH 8,0, 5 mM de EDTA, 0,5% de SDS. A proteinase inactivou com 300 µl de solução de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (com razão de 25: 24: 1) misturado e depois centrifugado a 12.000 rpm durante 10 min. A camada aquosa (camada superior) transferida para um tubo fresco, adicionada 600 de etanol e 30 de CH3COoNa 3 M e deixada a -70 oC durante 30 min, elimina o sobrenadante e enxagua-se com etanol a 80% e depois seca.(10) .
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
As amostras foram analisadas por PCR usando três conjuntos de primers, ou seja, GP 5+: 5'-ttggatccT TTG TTA CTG TAG ATA CTA C-3 '- GP 6+: 5'-ttggatccG AAA AAT AAA CTG TAA ATC ATA TTC-3 '(primers gerais para HPV) e A kit comercial projetado para PCR de partida a quente foram utilizados para todas as reações de amplificação, 16,18, 31,33,51,52,58 e primers 16, 18 ( para alto risco HPV) (Tabela / Fig. 2) .
As condições de PCR para estes iniciadores foram as seguintes: Para os iniciadores GP + 5 / GP + 6, o total de 25 µl de mistura reaccional de PCR continha 5 µl de amostra, 10mMtris-HCL, pH 9,0, 50mMKCL, 0,1% triton X-100, 1mMMgCL2, 200 trifosfato de desoxinucleotídeo µM (dNTPs), 0,4 pmole de cada primer e 0,2U de Taq polimerase. O perfil térmico da PCR foi a 95 oC por 5 min e 40 ciclos a 94 oC por 30 s, 45 oC por 30s, 72 oC por 30 s e extensão final de 5 min a 72 oC.
As condições de PCR para primers HPV 16,18 foram as mesmas que para os primers GP, exceto que para HPV 16,18 as temperaturas de anelamento foram 61 oc e 63 oc, respectivamente. O produto de PCR amplificado foi corrido em gel agse a 1,5% e corado com brometo de etio. Os produtos de PCR foram identificados com base no seu tamanho de fragmento previsto.
Para autenticar os nossos resultados, vários controlos foram utilizados no estudo (a) para validar os dados da PCR, o ADN de tecidos de controlo positivos de, por exemplo, amostras de carcinoma cervical conhecidas como sendo positivas para o subtipo de HPV 16, foi submetido a PCR. (b) O controle negativo foi incluído com o molde de DNA para controlar a contaminação do modelo. (Tabela / Fig 3) , (Tabela / Fig. 4) representam dois tipos de PCR convencional simples e multiplex.
Resultados
A média de idade do CCE no diagnóstico foi de 64 anos (mulheres 22 e homens 27) (variação: 35 a 81 anos). A prevalência do HPV foi maior entre homens do que entre mulheres. O estudo aqui relatado é o primeiro a compreender a prevalência de HPV na província de Guilan com carcinoma espinocelular de esôfago. O trabalho foi realizado retrospectivamente usando CEC embebido em parafina. 2005 a 2007 de quatro laboratórios patológicos diferentes. Estimamos a prevalência de HPV em 45 (4 amostras eram muito pequenas) biópsias de carcinoma espinocelular esofágico (ESCC) da província de Guilan de diversos estratos sociais e econômicos. Nossos resultados mostraram que 17 de 45 amostras de ESCC (37,7%) foram positivas para marcadores gerais de HPV, presença de GP5 / GP6. 4 de 45 amostras de ESCC (8,8%) foram positivas para os tipos oncogênicos, 31,33,51,52,58 (Tabela / Fig 5) .
Discussão
O carcinoma espinocelular esofágico (ESCC) é um dos cânceres humanos mais prevalentes em todo o mundo. A incidência de ESCC foi encontrada para ter variação geográfica acentuada. Na maioria dos países, as taxas de incidência de ESCC por 100.000 são de 2,5 a 5,0 para homens e 1,5 a 2,5 para mulheres, embora em certas regiões da Ásia, África do Sul, Irã, França e América do Sul (área de alta incidência ou alto risco), o risco relativo é tão alto quanto 300 vezes (11) , (12)Apesar de muitos fatores, como o consumo excessivo de tabaco, álcool e chá preto, até a nutrição pode ser a causa do câncer, mas alguns tipos de HPV parecem ser um fator. Nos últimos estudos, a incidência de HPV causa 10 a 67% em alguns países. A infecção por tipos de HPV oncogênicos está associada a 10% dos cânceres humanos em todo o mundo. A maioria desses cânceres se origina de epitélios escamosos do câncer anogenital e cervical. Acredita-se que o último evento seja necessário para persistência e atividade de transformação de oncogenes de HPV em linhagens de células tumorais, (13) , (14)embora a necessidade de integração de HPV para transformação maligna de células hospedeiras não tenha sido firmemente estabelecida em tumores humanos. No decurso da transformao maligna, as proteas precoces de HPV E6 e E7 interagem com o ancioncogene celular, como as proteas Rb e P53. Em particular, E6 pode complexar a proteína p53 e E7 liga-se a Rb, aumenta a sua degradação e, desse modo, altera o controlo normal do crescimento celular. O desvio dos pontos de checagem de p53 e Rb é necessário para qualquer tumor maligno e, portanto, não se espera que o tumor em desenvolvimento altere seus mecanismos oncogênicos precoces em fases consecutivas de desenvolvimento do tumor, uma vez que a inativação dessas proteínas foi realizada com sucesso pelo oncogene HPV na fase inicial. de desenvolvimento tumoral (15) , (16) .
O estudo relatado aqui é o primeiro de seu tipo a obter uma compreensão da prevalência do HPV em pacientes da província de Guilan com ESCC. O trabalho foi realizado retrospectivamente, usando biópsias ESCC embebidas em parafina de 2005 - 2007, de um hospital principal (Razi Hospitalar e 3 laboratórios de biologia de vias privadas) .A presença de DNA de HPV foi detectada em 37,7% dos casos de ESCC, 13,2% dos quais estavam infectados com mais de um tipo de HR-HPV (16, 18, 31, 33,51,52 e 58) e (4,4%) amostras foram de alto risco do gene HPV 16,18 E6 / E7 e 22 pacientes com ESCC foram negativos com diferentes tipos de HPV. . Esta freqüência está em concordância aproximada com relatos anteriores mucosa e lesões pré-cancerosas, mas é diferente em outro relatório do Turcomenistão Saara, província do Norte do Irã Golastan, que é mais do que 50% é claro que outros fatores, principalmente técnicos, pode ser responsável pela diferença observada nas taxas de detecção de HPV em diferentes estudos baseados em PCR. Este é um argumento forte e notório para esperar um papel carcinogênico para os tipos de HR-HPV no câncer de esôfago. No entanto, nossas análises estatísticas não identificaram qualquer diferença significativa nas variáveis ​​estudadas entre pacientes com ESCC-HR-HPV e HR-HPV-negativo.(17) . Estudos anteriores também indicaram associações obscuras entre a infecção viral e outras causas conhecidas de câncer de esôfago, como tabaco, álcool e chá preto quente, especialmente em provast Golastan. Em nossos pacientes, a prevalência de abuso de álcool por causa de crenças religiosas foi muito baixa em pacientes HIV-positivos e negativos, mas o uso de tabaco não foi estudado, mas o HR-HPV não foi significativamente mais freqüente nos pacientes que foram declarados livres desses fatores de risco mutagênicos estabelecidos. Apesar de 13,2% infectados com HPV de alto risco em 6 pacientes em nosso estudo e negativos em 22 pacientes com ESCC em Guilan com alta incidência de ESCC na província de Guilan, devemos procurar outros fatores nesta província ou combinação de alguns fatores causadores de ESCC na província de Guilan.
Em conclusão, nosso estudo confirma que a maioria dos ESCC originários de áreas geográficas de alto risco para este carcinoma não estão associados à infecção pelo HPV e outros mecanismos patogênicos são mais importantes na etiologia desse carcinoma. Esses estudos podem ser úteis na avaliação do potencial que medidas de intervenção anti-HPV podem ter na redução da morbidade causada por essa doença, que atualmente tem prognóstico ruim.
Reconhecimento
Este artigo foi fornecido financeiramente por uma bolsa de pesquisa do Centro de Pesquisa sobre Doenças do Fígado e Gastrointestinal (GLDRC) da Universidade de Guilan (Ciências Médicas). Gostaríamos também de expressar nossa profunda gratidão ao Dr.P.Sattari, Dr.Askari, Dr.S.Saffari e Dr.Haydarzadeh por seu suporte técnico e à Sra. Jokar, Mr.Khoshsoror e Sr. M.Kazemi pela ajuda de laboratório. .
Não declare.
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