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Abstrato
Objetivo: Estudar a correlação entre o estresse oxidativo sistêmico e a ambiência intracelular dos epitélios do cristalino em pacientes com catarata.
Materiais e Métodos: A espectrofotometria foi utilizada para estimar a atividade da catalase e a extensão da peroxidação lipídica nas células epiteliais do cristalino (LEC) e no plasma. Ambos são marcadores de estresse oxidativo. Nenhum medicamento antioxidante foi usado pelos pacientes com catarata inscritos neste estudo; do contrário, todos eram indivíduos saudáveis, sem nenhuma doença sistêmica.
Resultados:Um total de 56 pacientes com catarata foram incluídos neste estudo. A idade média dos pacientes foi 66,6 ± 8,3 (± DP) anos para os homens e 62,4 ± 10,0 anos para as mulheres. A atividade da catalase foi estimada na LEC removida cirurgicamente (221,16 ± 135,87 U / µg de proteína; média ± DP) e no plasma (277,56 ± 162.44 KU / mg Hb). Os níveis de MDA também foram calculados no LEC (1,28 ± 0,79nM / mg proteína) e no plasma (537,30 ± 238,47 nM / g proteína). A análise de regressão linear mostrou uma correlação positiva parcial na LEC e atividade da catalase plasmática (r: 0,701; p <0,05), mas não na MDA (r: 0,248; p> 0,05).
Conclusão:O aumento do estresse oxidativo sistêmico pode levar ao desenvolvimento ou progressão da catarata, afetando a ambiência intracelular dos epitélios do cristalino. Assim, indivíduos com alto estresse oxidativo sistêmico são mais vulneráveis ao desenvolvimento de catarata.
Palavras-chave
formação de catarata, epitélio de lente, catalase, peroxidação lipídica
Como citar este artigo:
MM REAL, VISHWAJEET P, MITTAL R, SUNE P. A POTENCIAL CORRELAÇÃO ENTRE O ESTRESSE OXIDATIVO SISTÊMICO E O AMBIENTE INTRACELULAR DA EPITÉLIA DA LENTE EM PACIENTES COM CATARATA. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2010 fevereiro [citado: 2018 31 de agosto]; 4: 2061-2067. Disponível em
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2010&month=February&volume=4&issue=1&page=2061-2067&id=621
Introdução A
catarata é a principal causa de cegueira em todo o mundo. Na Índia, achados contemporâneos sugerem que a população está amplamente exposta aos fatores de risco ambientais e / ou existe uma predisposição genética. Em um estudo recente sobre a população rural do norte da Índia, a prevalência de catarata na faixa etária> 50 anos foi de 75,3% (1) , que parece ser a mais alta do mundo. Mesmo com todos os recursos disponíveis, os médicos estão achando difícil erradicar completamente a cegueira induzida por catarata (2) . Portanto, é imprescindível descobrir os fatores causais para a prevenção do desenvolvimento da catarata.
Vários fatores de risco foram identificados para o desenvolvimento da catarata humana: envelhecimento, diabetes, desnutrição, pobreza, luz solar, tabagismo, hipertensão e insuficiência renal (3) . Embora a catarata seja uma doença multifatorial, acredita-se que os mecanismos oxidativos desempenham um papel importante na patogênese da catarata com início na maturidade, a causa mais importante de deficiência visual em idade avançada. O stress oxidativo (SO) ocorre quando o nível de pró-oxidantes (espécies de oxigénio reactivo e de outros radicais livres) excede a capacidade da célula para responder através das defesas antioxidantes e, finalmente, conduz à modificação e degradação de proteínas, danos ao ADN e mitocôndrias e morte celular (4). O aumento da produção de radicais livres e a oxidação de lipídeos insaturados têm sido observados em lentes de catarata (5) e humor aquoso. As células epiteliais da lente (LEC) são o principal local de dano oxidativo, que acaba afetando toda a lente, afetando a clareza da lente e levando à patogênese da catarata (6) , (7) .
Por outro lado, há muitos anos, evidências experimentais sugerem uma associação entre nutrição e opacidade das lentes. Aumento OS sistémica tem sido observada em pacientes de catarata (8]. Em outros estudos, os parâmetros das suas defesas antioxidantes são mais baixos e os de SO são mais elevadas no soro, no cristalino e no humor aquoso (9) .
Mas o estresse sistêmico (oxidativo) e seus efeitos sobre a ambiência intracelular dos epitélios do cristalino não foram correlacionados diretamente em amostras humanas patológicas. Portanto, o presente estudo foi realizado para examinar a correlação entre estresse oxidativo em LEC cirurgicamente removido e plasma de pacientes com catarata.
Material e métodos
Seleção dos pacientes
Este estudo consistiu em 56 pacientes consecutivos com catarata não complicada relacionada à idade, submetidos à facoemulsificação. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. Apenas pacientes com idade superior a 50 anos, com pupilas dilatadas acima de 7,0 mm e com olhos normais, foram incluídos no estudo. Os critérios de exclusão foram diabetes mellitus, hipertensão, glaucoma, câmara anterior rasa, miopia alta (comprimento axial O27,0 mm), pseudoexfoliação, catarata traumática, catarata subluxada, cirurgia ocular prévia, doença ocular, terapia com esteroides ou imunossupressores e alergia a gotas dilatadoras .
Coleta e Processamento de Amostras
Obtiveram-se p�s circulares de c�sda de lente anterior humana catar�ica (rhexis), com cerca de 6 mm de di�etro, no p�-operat�io, em solu�o salina normal est�il. O tipo de catarata foi observado usando o sistema de classificação LOCs (10) . As cápsulas anteriores tomadas para todos os experimentos pertenciam à catarata senil imatura. Para aclimatização, uma única rhexis foi colocada em 1 ml de Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM) contendo soro bovino fetal a 10% em um único poço de uma placa de 24 poços e foi incubado por 30 min em incubadora com CO2 a 370C.
Amostras de sangue em jejum foram coletadas em um bulbo de vidro contendo EDTA de pacientes, e seu consentimento verbal foi obtido. O plasma foi separado e armazenado a -20 ° C até análise.
Teste de Viabilidade Celular
O teste de exclusão do azul de Typan foi utilizado para garantir a viabilidade celular. Neste teste, algumas gotas de tímpano azul são adicionadas em uma rhexis, colocadas em uma lâmina de vidro e examinadas microscopicamente para determinar se as células retiram ou excluem o corante. Uma célula viável terá um citoplasma claro, enquanto uma célula não viável terá um citoplasma azul.
Ensaio Bioquímico
O nível de malondialdeído (MDA) foi medido como um índice de peroxidação de lipídios usando o método de Beuge e Aust (11) . As atividades de catalase de plasma e LECs foram medidas pelo método de Luck (12) . A atividade específica da catalase foi calculada em LEC pela medição de proteína usando o método Eosin Y (13) e no plasma, estimando-se a hemoglobina usando o método O-tolidine(14) . Os métodos são descritos aqui em breve.
Ensaio de Catalase
O extrato de enzima foi preparado por homogeneização das células em um tampão de lise (sacarose 0,25M, tris-HCl 20mM, KCl 100mM, NaCl 40mM e MgCl2 10mM), centrifugando-as a 20 000g por 30 min a 41C e por -extrair o sedimento num tampão de diluição microssomal (KH2PO4 0,1 M, glicerol a 20%, EDTA 10 mM e b-mercaptoetanol 0,1 mM). O extrato reunido foi adicionado a 10mM de H2O2 e a taxa de decomposição de H2O2 foi medida espectrofotometricamente a 240nm. A decomposição de 1 mM de H2O2 em 1 min corresponde a 1U de catalase.
Peroxidação lipídica / ensaio MDA
O reagente TBA-TCA-HCl (0,8 ml) foi adicionado a 0,2 ml de plasma. A mistura foi fervida em banho-maria a ferver durante 15 min. Após a centrifugação, a absorbância do sobrenadante foi registrada espectrofotometricamente a 535 nm. Absorvância em branco (salina) devido aos reagentes foi subtraída da amostra experimental correspondente. O conteúdo de MDA na amostra foi calculado usando um coeficiente de extinção de 1,56 × 105 / M / cm. a 535 nm. No LEC, as células foram homogeneizadas em água destilada e foram centrifugadas a 12.000 g a 4 ° C por 30 min. Alíquotas deste homogeneizado foram usadas como amostra em vez de plasma no procedimento acima.
Estimativa de Proteína
Foram adicionados 100 da amostra a 1,0 ml do reagente (0,012% de Eosin Y Dye e 0,6% de ido crico; pH: 2,6-2,8) e foi incubado durante 15 min temperatura ambiente. A absorvância foi medida espectrofotometricamente a 543 nm.
Estimativa de Hemoglobina Plasmática
1,0 ml de solução de trabalho [0,4 gm% de o-tolidina, 0,1% de triton x-100 em solução (20:80) de ácido acético glacial e etanol] e 1 ml de solução de H2O2 preparada de fresco [2% H2O2 e 2,26% p / v de acetato de sio em ua destilada] foram misturados em tubos de ensaio e esta foi mantida durante 5 min para maturao do reagente. 10 µL de padrões de hemoglobina (6 a 400 mg / L) e amostras foram adicionadas aos respectivos tubos de ensaio e imediatamente, ∆Abs por minuto foram medidos a 630 nm com um tempo de atraso de 30 segundos. Água destilada foi usada como branco reagente.
Resultados
Um total de 56 amostras de rexis foram coletadas de pacientes com catarata senil imatura, com idade média de 66,6 ± 8,3 (± DP) anos para homens e 62,4 ± 10,0 anos para mulheres. Eles (machos e fêmeas) eram aproximadamente iguais em número. Analisamos 25 amostras para MDA e 31 amostras para atividade de catalase separadamente, em LEC e plasma dos mesmos pacientes.
Viabilidade celular e aclimatização
Observou-se que as células epiteliais do cristalino que estavam presentes na capsulorrexe permaneceram viáveis até 2 horas em PBS, como mostra a figura 1A. Mais de 90% das células tinham citoplasma claro (células vivas) até 2 horas, enquanto as restantes células captavam o corante (células mortas). LECs morreram rapidamente após 2 horas em PBS (Figura 1B) (Tabela / Fig 1). No entanto, no presente estudo, levou no máximo vinte minutos para inserir a amostra no processo após sua remoção do olho.
Correlação entre a Atividade da Catalase no Plasma e na LEC A
atividade específica da catalase foi medida tanto na LEC (média ± SD; 221,16 ± 135,87 U / µg de proteína) como no plasma (277,56 ± 162.44 KU / mg de Hb) do mesmo paciente . Foi encontrada uma correlação linear positiva parcial (r: 0,701, p <0,05) entre a atividade da catalase nas LECs e no plasma dos pacientes com catarata (Tabela / Fig. 2) .
A correlação entre o MDA no Plasma e no
nível de LEC MDA foi medida em LECs (1,282 ± 0,798 nM / mg de proteína; média ± DP) e no plasma (537,30 ± 238,47 nM / g de proteína) do mesmo paciente. Como mostrado na (Tabela / Fig 3), Os níveis de MDA nos LECs são pouco correlacionados (positivos) com os níveis plasmáticos de MDA. O coeficiente de correlação (r) foi de apenas 0,248. Isso estava de acordo com os resultados de outros trabalhadores (15) .
Discussão
O nível elevado de marcadores de estresse oxidativo é relatado no soro e hemácias em pacientes com catarata. Dados experimentais e observacionais sugerem que a suplementação oral ou o aumento dos níveis sanguíneos de micronutrientes que podem reduzir o estresse oxidativo podem retardar o desenvolvimento da catarata relacionada à idade (16) , (17) , (18) , (19) .
No presente estudo, tentamos descobrir a correlação entre estresse oxidativo sistêmico e LEC. Nos estudos anteriores, células de lentes inteiras (5) , (8)ou amostras de humor aquoso foram usadas para ver a correlação de diferentes factores no tecido ocular e no sangue. A geração de radicais livres é um excesso indesejado de metabolismo e é um processo contínuo nas células vivas. A maioria das células da lente (exceto as células epiteliais) e o humor aquoso não contêm organelas celulares e, portanto, não são metabolicamente ativas. O conteúdo da lente é resultado da difusão dos LECs. Assim, a avaliação dos efeitos do estresse oxidativo sistêmico no cristalino deixa uma questão sobre como essas células, que não são capazes de metabolismo geral, reagem contra o estresse.
Novamente, existem outros fatores também que podem induzir a geração de radicais livres no entorno da lente, como a luz UV. O humor aquoso normalmente contém peróxido de hidrogênio (H2O2), um composto capaz de gerar espécies reativas de oxigênio (ROS). Os sistemas que protegem o cristalino ocular dessas ERO (ou dano oxidativo) estão basicamente confinados ao epitélio, uma única camada de células no lado anterior do órgão que se encontra diretamente abaixo da cápsula do cristalino (20) . Esses LECs são centros de atividades metabólicas de lentes, pois contêm mitocôndrias máximas do que qualquer outra parte da lente (21) . Alguns dados sugerem que essas células são o local inicial de ataque por estresse oxidativo e seguem as fibras do cristalino, levando à catarata cortical (22) ,(23) . Assim, os LECs têm grande importância na cataratogênese e foram empregados para estudar as mudanças provocadas pelo estresse oxidativo (22) . A cirurgia de catarata pode induzir algum estresse na LEC (24) . Para evitar isso, a etapa de aclimatação foi introduzida. O mesmo modelo foi usado anteriormente pelos nossos co-autores também (25) , (26) [, 27].
Como as EROs são altamente instáveis, suas medições em amostras de soro ou plasma humano não refletem necessariamente sua concentração in vivo. Portanto, apenas produtos secundários (finais) do estresse oxidativo surgiram para aplicação em estudos clínicos. O malondialdeído (MDA) é um produto natural da peroxidação lipídica, um mecanismo bem estabelecido de lesão celular por ERO em plantas e animais e é usado como um indicador de estresse oxidativo em células e tecidos.
H2O2 é o principal oxidante envolvido na formação de catarata (28) . Há um aumento significativo na concentração de H2O2 durante a cataratogênese (17) . Em condições in vitro também, concentrações relativamente altas de H2O2 são necessárias para causar mudanças significativas nas células epiteliais do cristalino.(4) . Duas das principais enzimas antioxidantes utilizadas pelas lentes para combater o H2O2 são a catalase e a glutationa peroxidase (29) . A glutationa peroxidase desempenha um papel importante na remoção do H2O2 que está presente em baixas concentrações nas células, enquanto a catalase é mais efetiva com altas concentrações de H2O2 (30) . Em outro relato, a causa da morte celular após a inibição da catalase foi identificada como relacionada a uma incapacidade da LEC em cultura de remover o peróxido do meio de cultura a uma taxa rápida, seguindo o pulso de H2O2 (31) . Catalase também protege outras enzimas antioxidantes dos efeitos destrutivos do H2O2 (32). Assim, a catalase foi preferida à glutationa peroxidase e foi usada como um marcador indireto para avaliar o estado oxidativo da amostra. Nas lentes de um modelo experimental, observou-se uma leve estimulação dos sistemas antioxidantes por um pequeno número de radicais livres, o que provocou uma reação de varrê-los (33) . Talvez pelo mesmo mecanismo, sua atividade (catalase) seja aumentada para neutralizar o aumento do estresse oxidativo (em termos de H2O2), seja na LEC ou no sangue (sistêmico) (34) .
Tanto a atividade da catalase quanto os níveis de MDA são bons marcadores do estresse oxidativo. Um aumento na atividade da catalase plasmática e MDA reflete o aumento do estresse oxidativo sistêmico, que pode ser o resultado de má nutrição ou tabagismo e hábitos de mastigação do tabaco ou exposição ambiental, ou todos eles. O tecido corporal, incluindo LEC, pode reagir contra o estresse oxidativo de duas maneiras. Uma é aumentar a síntese de enzimas antioxidantes como catalase e glutationa peroxidase e a segunda é através de maior consumo de substratos antioxidantes como glutationa reduzida, vitamina C e vitamina E. Devido ao aumento da OS, o consumo de substratos antioxidantes pelos tecidos do corpo aumenta e portanto, sua disponibilidade é reduzida através da barreira hematoencefálica (BHE), uma estrutura membranosa que atua principalmente para proteger o cérebro de substâncias químicas no sangue, enquanto ainda permite a função metabólica essencial. Desta forma, uma ligeira diminuição na disponibilidade de substratos antioxidantes para LEC, que é continuamente exposta a fatores que provocam geração de radicais livres como a luz, leva essas células para OS. Se esta condição persistir por um longo tempo, ela afeta toda a lente e sua clareza por modificação ou degeneração de DNA, proteínas e outras biomoléculas como lipídios. Estas células também respondem aumentando a síntese de catalase e, se não responder, a catarata se desenvolve. Isso é indicado por alguns achados em que a atividade da catalase em pacientes com catarata foi significativamente menor do que nos controles que é continuamente exposto a fatores que provocam a geração de radicais livres como a luz, leva essas células ao sistema operacional. Se esta condição persistir por um longo tempo, ela afeta toda a lente e sua clareza por modificação ou degeneração de DNA, proteínas e outras biomoléculas como lipídios. Estas células também respondem aumentando a síntese de catalase e, se não responder, a catarata se desenvolve. Isso é indicado por alguns achados em que a atividade da catalase em pacientes com catarata foi significativamente menor do que nos controles que é continuamente exposto a fatores que provocam a geração de radicais livres como a luz, leva essas células ao sistema operacional. Se esta condição persistir por um longo tempo, ela afeta toda a lente e sua clareza por modificação ou degeneração de DNA, proteínas e outras biomoléculas como lipídios. Estas células também respondem aumentando a síntese de catalase e, se não responder, a catarata se desenvolve. Isso é indicado por alguns achados em que a atividade da catalase em pacientes com catarata foi significativamente menor do que nos controles catarata se desenvolve. Isso é indicado por alguns achados em que a atividade da catalase em pacientes com catarata foi significativamente menor do que nos controles catarata se desenvolve. Isso é indicado por alguns achados em que a atividade da catalase em pacientes com catarata foi significativamente menor do que nos controles(35) . Os resultados da análise de regressão linear (Figura 2) endossaram a referida matéria e encontraram uma correlação entre a atividade da catalase na LEC e no plasma do mesmo paciente (r: 0,701, p <0,05). Esses resultados estão de acordo com os de outros grupos que trabalharam na mesma hipótese e relataram uma correlação entre diferentes enzimas e produtos de lipoperoxidação (36) . Alguns relatos contraditórios que também estão disponíveis (6) , (15) , podem ser o resultado da presença de outros fatores além dos níveis elevados de H2O2. Não encontramos nenhum relato em que as atividades da catalase na LEC cirurgicamente removida e no plasma foram correlacionadas.
Os níveis plasmáticos de MDA são pouco correlacionados (Figura 3) com os níveis de MDA nos LECs. Nos estudos anteriores, uma correlação inversa de MDA e atividade da catalase foi relatada. É bastante óbvio, pois ambos são produzidos por mecanismos opostos. A modificação lipídica (peroxidação) por ERO resulta em um aumento nos níveis de MDA, enquanto o aumento da atividade da catalase mostra um mecanismo de defesa elevado nas células. Esta pode ser a razão para a fraca correlação (Figura 3), pois o aumento da atividade da catalase diminui o estresse oxidativo na LEC e inibe a peroxidação lipídica (formação de MDA).
Embora nossos resultados sejam de um tamanho de amostra relativamente pequeno, eles sugerem alguns achados intrigantes e potencialmente provocativos que sugerem que o estresse oxidativo sistêmico pode aumentar o mesmo (OS) em LECs. Esta alteração no ambiente intracelular dos epitélios do cristalino pode levar à modificação de DNA, proteínas e outras biomoléculas e pode resultar no desenvolvimento ou progressão da opacidade do cristalino. A partir disso, podemos concluir que indivíduos com aumento do estresse oxidativo sistêmico são mais vulneráveis ao desenvolvimento de catarata e, portanto, a suplementação oral ou o aumento dos níveis sangüíneos dos antioxidantes podem ser benéficos na prevenção da cataratogênese. Além disso, mais estudos com um aumento do tamanho da amostra e diferentes marcadores de estresse são necessários para definir o papel inequívoco do estresse oxidativo no desenvolvimento da catarata.
Reconhecimento
Somos gratos ao Dr. Vijay Babar, Assist. Professor do Departamento de Educação Médica, DMIMS, Wardha, por sua ajuda como estatístico.
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