Medical Clinic

Departamentos de Bioquímica e Dermatologia Jawaharlal Nehru Medical College, Instituto Datta Meghe de Ciências Médicas. University, Wardha-442004 (Índia)

Endereço para correspondência : 
Anjan Basak 
e-mail: drabasak1@yahoo.com

 

 

Abstrato

Antecedentes: Porfiria é um grupo de doenças genéticas que requerem instalações laboratoriais especializadas para o diagnóstico preciso. As instalações para o diagnóstico de porfiria foram estabelecidas em nossa instituição desde 1996, com poucas investigações bioquímicas em correlação com os achados clínicos. 
Materiais e Métodos: A quantificação das porfirinas totais urinárias foi realizada por espectrofotômetro computadorizado de duplo feixe. O porfobilinogênio urinário (PBG) é rastreado pelo teste de Hoesch (1) e confirmado pelo teste de Watson-Schwartz (2). A presença de PBG na urina foi confirmada por varredura de comprimento de onda por espectrofotômetro. 
Resultados e discussão:Valor normal de porfirinas totais na urina: <35nmol / µmol de creatinina. Nos últimos 12 anos, diagnosticamos quatro casos de porfiria. Os dois casos foram diagnosticados como porfiria aguda intermitente (AIP), com base no aumento dos níveis de urina porfirinas totais, aumento da PBG na urina com sintomas de ataque neurovisceral agudo. Em um caso, houve um aumento no nível total de porfirinas na urina até 91,6 nmol / µmol de creatinina com história de fotossensibilidade, bolhas de pele com cicatrizes desde a infância. O caso foi diagnosticado como Porfiria Eritropoética Congênita (CEP). No outro, as porfirinas urinárias totais foram aumentadas até 1695 nmol / µmol de creatinina e a PBG urinária esteve ausente com sinais de manifestações cutâneas devido a fatores precipitantes. Este caso foi diagnosticado como Porphyria Cutanea Tarda (PCT). 
Conclusão: Qualquer laboratório de bioquímica com espectrofotômetro pode diagnosticar a porfiria com correlação clínica.

 

 

Como citar este artigo:

SORTE K, PALANDURKAR K, GOYAL M, SINGH AL, BASAK A. DIAGNÓSTICO DA PORFIRIA MEDINDO METABÓLITOS DE BIOSSÍNTESE DE HEMAS EM CORRELAÇÃO COM DESCOBERTAS CLÍNICAS. Jornal de Pesquisa Clínica e Diagnóstica [serial on-line] 2010 fevereiro [citado: 2018 31 de agosto]; 4: 2031-2035. Disponível em 
http://www.jcdr.net/back_issues.asp?issn=0973-709x&year=2010&month=February&volume=4&issue=1&page=2031-2035&id=647

 

Porfiria é o grupo de doenças genéticas resultantes devido ao defeito na biossíntese do heme. Defeito em cada enzima dá origem a diferentes porfiria com manifestações clínicas variáveis. 

O diagnóstico preciso de porfiria requer instalação laboratorial bem equipada, mas poucas investigações laboratoriais de primeira linha devem ser feitas 
sempre que os achados clínicos sugerirem porfiria. (Tabela / Fig. 1) 

Objetivos e objetivos
Diagnosticar a porfiria medindo os metabólitos da biossíntese do heme em correlação com as características clínicas.

 

 

Material e métodos

Métodos simples usando técnica de espectrofotometria foram usados ​​no estudo para investigações iniciais dos pacientes que são clinicamente suspeitos de porfiria. 

Instrumentos
1. Espectrofotômetro (ELICO, Modelo N ° BL-198) 
2. Centrífuga 
3. Misturador Vortex 

Reagentes
1. Reagente de Ehrlich (solução teste de Hoesch): 2 g de p-dimetilaminobenzaldeído em 100 ml de 6 M, HCl. Estável por 09 meses em temperatura ambiente (1) . 
2. Reagente de Ehrlich (solução teste de Watson-Schwartz): 0,7 g de p-dimetilaminobenzaldeído em 150 ml de HCl concentrado, adicionar 100 ml de água e misturar (1) . 
3. Solução saturada de acetato de sódio 
4. Clorofórmio 
5. Butanol
6. Kit de estimativa de creatinina pelo método cinético de Jaffe 

Colheita e estabilidade das
amostras Todas as amostras devem ser protegidas da luz; As concentrações de porfirina urinária podem diminuir em até 50% se forem mantidas à luz por 24 horas. O PBG urinário e as porfirinas são melhor analisados ​​em uma amostra fresca e aleatória (10-20 ml) coletada sem conservante (Tabela / Fig. 2) . As coleções de vinte e quatro horas oferecem pouca vantagem, retardam o diagnóstico e aumentam o risco de perdas durante o período de coleta. PBG e porfirinas são estáveis ​​na urina no escuro a 4 ° C por até 48 horas e por pelo menos um mês a -20 ° C. Urina muito diluída (creatinina <4 mmol / litro) é inadequada para análise (Tabela / Fig. 2) . 


Procedimento para realização dos testes
PBG na urina

Teste de triagem para teste de 

Hoesch PBG : foi usado como um teste de triagem para PBG (1) . 2 ml de reagente de Ehrlich foram colocados num tubo de ensaio e depois cobertos com 3 gotas de urina. Se .PBG estava presente, uma cor vermelha cereja imediata se desenvolveu no ponto de mistura. Teste falso positivo pode ser encontrado pela presença de corantes indicadores derivados de alimentos, refrigerantes, medicamentos, etc (3) (Tabela / Fig. 3) . 


O teste confirmatório para o teste PBG 
Watson-Schwartz foi usado como teste confirmatório para o PBG (1). Este teste foi realizado apenas em amostras positivas do teste de Hoesh. Em 2 ml de urina, foram adicionados 2 ml de reagente de Ehrlich e misturados bem, depois misturados com 4 ml de solução saturada de acetato de sódio. O pH do reagente foi definido entre 4-5 com papel indicador de pH de gama estreita. Agora, 3,0 ml de clorofórmio foram adicionados e agitados em vórtice durante 1 min. O tubo foi mantido sem perturbação para que as fases se separassem. A camada aquosa superior foi examinada para cor magenta. Se a cor magenta não se desenvolveu, então não houve necessidade de prosseguir. Removeu-se a camada de clorofmio inferior e adicionou-se 2,0 mL de n-butanol e agitou-se em vtice durante 1 min. A cor magenta foi examinada em camada aquosa inferior que indicou a presença de PBG. O procedimento de extração de butanol foi repetido duas vezes. Isso aumentou a especificidade da detecção de PBG (Tabela / Fig. 4) .


Espectros de absorção de PBG: O PBG reage com o reagente aldeído de Ehrlich (do teste Watson-Schwartz) em meio ácido para dar produto de condensação vermelho com espectro de absorção característico que tem pico a 553 nm e precedido por um ombro a 540 nm. Para gerar este espectro de absorção de PBG, utilizou-se a camada aquosa de cor magenta do teste de Watson-Schwartz (3) (Tabela / Fig. 5) . 


Método cinético de Jaffe para estimativa de creatinina: Diluição de urina: para 9,9 ml de água de grau analítico 100μL de urina foi misturada para obter 100 vezes a urina diluída. A 500μL de reagente de picrato alcalino (250μL de reagente de ácido pícrico foi adicionado a 250μL de solução de hidróxido de sódio) 100μL de urina 100 vezes diluída foram misturados. A leitura foi feita no analisador por 60 segundos com atraso inicial de 20 segundos a 492nm.

Total de porfirinas na urina: misturaram-se 4 ml de urina centrifugada com 1 ml de HC1 concentrado. Os materiais não dissolvidos foram removidos por centrifugação. Foram recolhidos 0,5 ml de sobrenadante em cuvete e efectuou-se o varrimento de comprimento de onda em espectrofotómetro entre 350 nm a 450 nm contra ar em branco. Se o pico de absorbância foi encontrado próximo a 400 nm (banda de Soret), então a presença de porfirinas foi confirmada (3) . 


Porfirinas urinárias totais = A x 2500 (3) 
μmol de creatinina / litro de urina 

“A” é o pico de absorbância acima da linha de base entre dois pontos adequados, como mostrado na (Tabela / Fig. 4) .
O factor 2500 foi derivado do volume de urina, o volume de ácido (assim a diluição da amostra é 5 vezes) e o coeficiente de extinção milimolar ie 500 que foi aproximadamente o de uma mistura 7: 1 (mol: mol) de coproporfirina-III e uroporfirina-III em HCl 2,3M. A composição de porfirina desta mistura assemelhava-se à da urina normal (3) .

 

 

 

Resultados

O valor normal de pophyrins total na urina: <35 nmol / m mol de creatinina (3) . Os resultados da investigação bioquímica foram correlacionados com os achados clínicos para diagnosticar diferentes tipos de porfiria (1) . 

Em dois casos de PAI, pacientes com história de ataque neurovisceral agudo, dor abdominal muito grave, mal definida, dor nas extremidades, perda sensorial com queixas de convulsão, ansiedade e alucinações. Eles tinham mais simpática atividade caracterizada pela pressão arterial elevada e sudorese. Eles eram assintomáticos até a puberdade, mas tiveram início súbito dos sintomas após a puberdade. Não houve manifestações cutâneas. Aumento de PBG urinário foi detectado pelo teste de Watson-Schwartz e confirmado por varredura de comprimento de onda com espectrofotômetro. Assim, os pacientes foram diagnosticados como casos de PAI (1) .

No caso do CEP, a criança tinha história de fotossensibilidade severa desde o nascimento, persistência da pele frágil com bolhas, infecções e cicatrizes (Caso 2) sobre a pele e características de mutilação de dígitos (Caso-2 (a)) e características faciais como Eritrodontia, ou seja, dentes de cor castanha avermelhada; houve uma história de fraldas coradas rosa durante a infância, devido à excreção de porfirina através do suor e córnea foi danificada devido à fotossensibilidade (1) . O total de urina porfirina foi 91,6 nmol / μmol de creatinina e o PBG urinário estava ausente. Assim, o paciente foi diagnosticado como um caso de CEP (1) .

No caso da PCT, pacientes do sexo masculino com 24 anos de idade e manifestações cutâneas severas em áreas expostas na pele foram precipitados pela ingestão inicial de álcool (caso 1) sem sintomas neuroviscerais. As porfirinas urinárias totais aumentaram até 1695 nmol / μmol de creatinina e o PBG urinário estava ausente. Então, o paciente foi diagnosticado como um caso de PCT (1) .

 

 

Discussão

Amostra de urina
Nós formulamos este fluxograma pelo qual podemos simplificar o diagnóstico de porfiria com os testes descritos acima correlacionando com os achados clínicos relevantes. Este fluxograma será útil para todos aqueles que estão dispostos a fazer o diagnóstico de porfiria (Tabela / Fig 6) . 

Neste, nós incorporamos o teste de Hoesch como um teste de triagem para o porfobilinogênio urinário (PBG). 

Dos quatro casos, dois casos foram de PAI e um caso de PCT e outro de CEP.

Em dois casos, pacientes com dor abdominal muito grave mal definida, dor nas extremidades, perda sensorial com queixas de convulsão, ansiedade e alucinações. Eles tinham mais simpática atividade caracterizada pela pressão arterial elevada e sudorese. Eles eram assintomáticos até a puberdade, mas tiveram início súbito dos sintomas após a puberdade. Não houve manifestações cutâneas. Assim, seus achados clínicos foram sugestivos de Porfiria Intermitente Aguda. Então, eles foram examinados pela primeira vez com o teste de PBG urinário de Hoesch. Quando considerados positivos, foram posteriormente detectados pelo teste de Watson-Schwartz para o aumento do PBG e confirmado por varredura de comprimento de onda com espectrofotômetro. Assim, os pacientes foram diagnosticados como casos de PAI.

Em outro caso, um paciente do sexo masculino de 24 anos com manifestações cutâneas severas sobre áreas expostas foi precipitado pelo consumo de álcool (caso 1), sem sintomas neuroviscerais; Então, eles foram selecionados pela primeira vez com teste de Hoesch PBG urinário. Quando se encontrou negativo, foram estimadas as porfirinas urinárias totais, que foram elevadas até 1695 nmol / μmol de creatinina. Assim, o paciente foi diagnosticado como um caso de Porfiria Cutânea Tarda. 

Em um caso, a criança tinha história de fotossensibilidade severa desde o nascimento, persistência da pele frágil com bolhas, cicatrizes e infecções (Caso 2) sobre a pele e características de mutilação de dígitos (Caso 2 (a) e características faciais; Foi uma história de fralda corante rosa durante a infância devido à excreção de porfirina através do suor e a córnea foi danificada devido à fotossensibilidade.

Então, ele foi rastreado pela primeira vez com teste de Hoesch PBG urinário. Quando consideradas negativas, foram estimadas as porfirinas urinárias totais, que foram de 91,6 nmol / μmol de creatinina. Assim, o paciente foi diagnosticado como um caso de porfiria eritropoética congênita. 

Da mesma forma, todos os outros tipos de porfiria podem ser diagnosticados seguindo o mesmo protocolo. 

Esses 04 casos foram diagnosticados em nosso laboratório com teste simples e por espectrofotômetro de feixe duplo. A estimativa individual de porfirinas requer mais fracionamento de solvente da urina de 24 horas, seguida de identificação e quantificação por espectrofotômetro. Como temos facilidade limitada, diagnosticamos os casos que correlacionam nosso achado laboratorial com características clínicas.

Se a cor magenta se desenvolve na camada inferior que indica a presença de urobilinogênio A coprorfirinúria secundária é observada no alcoolismo da disfunção hepática e envenenamento por chumbo, mas sem características clínicas típicas da porfiria. A espectroscopia de fluorescência é necessária para a diferenciação entre porfiria e psudoporfiria causada por drogas antiinflamatórias não esteroidais e algumas outras drogas nas quais o metabolismo da porfirina é normal. Diferenciação de VP e HCP é difícil com o nosso laboratório, mas isso pode ser conseguido através de emissão de fluorescência de plasma por espectrofluorofotômetro para identificar o diagnóstico.

 

 

Conclusão

Com instalações laboratoriais limitadas, poderíamos diagnosticar três variedades diferentes de porfiria. Nossa mensagem é que qualquer laboratório com espectrofotômetro com modo de varredura de comprimento de onda pode diagnosticar casos de porfiria com correlação clínica, como fizemos.

 

 

 

Reconhecimento

Os autores reconhecem fortemente o Instituto Datta Meghe da Universidade de Ciências Médicas, Wardha (Índia), por financiar este trabalho e também o Dr. Silpi Basak, Professor de Microbiologia, por conceber a massagem deste artigo.

 

Referências

 

1.

Labbe RF e Lamon JM, Porfirinas e Distúrbios do metabolismo da porfirina, In: Tietz NW et al. ai., Textbook of Clinical Chemistry, 2 ed; WBSaunders, 1986; p.1589-1611.

2.

Desnick RJ, As Porfirias, IN: Kasper DL et. al., Principles of Internal Medicine de Harrison, 16 ed, vol- II; McGraw-Hill, 2005; p.2303-7.

3.

Diácono AC e Elder GH. Testes de linha de frente para a investigação de suspeita de porphyria.J.Clin.Path. 2001; 54: 500-7.

4.

Anderson KE, Lee C e Desnick R., The Porphyrias, IN: Kliegman et. al .; Livro de Nelson de Pediatria, 18ed, vol-I, parte I-XVI, Elsevier, 2007; p.637-54.