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MAHENDRA J, MAHENDRA L, KURIAN VM, JAISHANKAR K
* (MDS) Professor Associado do Departamento de Periodontia do Meenakshi Ammal Dental College e Hospital, Chennai 600095, Índia. ** (MDS) Docente Sênior, Departamento de Periodontia, Faculdade e Hospital de Odontologia Rajah Muthaiah, Universidade Annamalai, Annamalai Nagar 608002, Índia. *** (MS), (Mch), (DPMR) Consultor Sênior, Cirurgião Cardíaco Torácico. **** (MD), (DM) Consultor, Cirurgião Cardíaco Torácico, Instituto de Doenças Cardiovasculares, Missão Médica de Madras, Chennai 600037, Índia.
Endereço para correspondência :
Jaideep Mahendra, MDS., Ph.D., PGDHM.,
X-1 / 1-2 SAF Games Village,
Koyambedu, Chennai-600 107,
Tamil Nadu, Índia
Mobile No. + 91- 9444963973
Fax No. + 91-44-24343205
email: jaideep_m_23@yahoo.co.in
Abstrato
Introdução: Estudos recentes indicam que infecções bacterianas crônicas são um importante fator de risco para doença arterial coronariana. A inflamação iniciada pelas bactérias e seus componentes pode ser o fator causal comum na progressão da aterosclerose. A capacidade dos patogénios orais para colonizar na placa aterosclerótica coronária é bem conhecida.
Objetivos: O objetivo deste estudo foi detectar a presença de patógenos orais periodontais; isto é, o gene Porphyromonas gingivalis (fimA), Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Prevotella nigrescens nas amostras de placa aterosclerótica dos pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio.
Configurações e Design: A população do estudo consistiu de 51 pacientes com infecção periodontal crônica na faixa etária de 40 a 80 anos e foram recrutados consecutivamente do Instituto de Doenças Cardiovasculares, Madras Medical Mission, Chennai. Estes pacientes sofriam de Doença Arterial Coronariana e estavam sendo submetidos ao Enxerto de Artéria Coronária.
Métodos e Materiais: O DNA foi extraído da placa subgengival e das amostras de placa aterosclerótica coronariana dos mesmos pacientes. A reação em cadeia da polimerase foi usada para amplificar a parte do gene 16S rRNA para detectar a presença dos microorganismos acima.
Análise Estatística: Medidas Kappa de Acordo, Resultados da Prevalência Percentual
: O DNA bacteriano foi detectado em todas as amostras de placas subgengivais e ateroscleróticas. Forsythia de Tannerella, Porphyromonas gingivalis, gene Porphyromonas gingivalis (fimA) e Prevotella nigrescens foram detectados em 31,4%, 45,1%, 39,2% e 21,6% das amostras de placa aterosclerótica. Em ambas as amostras de placa subgengival e aterosclerótica coronariana, T. forsythia foi detectada em 19,6%, P.gingivalis em 39,2%, P.gingivalis (fimA) em 33,3% e P. nigrescens em 15,7% das amostras. 11,8% de T.forsythia, 5,9% de P.gingivalis, 5,9% do gene P.gingivalis (fimA) e 5,9% de P.nigrescens foram encontrados apenas em placas coronárias sem a presença desses microrganismos em placas subgengivais.
Conclusão:Nosso estudo confirmou a detecção do DNA dos microrganismos acima em amostras de placa coronária. Isso pode explicar que a inflamação na cavidade oral desencadeia e influencia o processo aterosclerótico.
Palavras-chave
1. Aterosclerose, 2. Periodontite, 3. Reação em Cadeia da Polimerase, 4. Inflamação e Doença Cardíaca Coronária
Introdução
Os dados recentes sugerem que as bactérias orais estão implicadas na etiologia da aterosclerose (1) , (2) Desde então, foram relatadas associações entre aterosclerose e infecções crônicas com Helicobacter pylori, herpesvírus e infecção dentária crônica (3) . Porphyromonas gingivalis fimbriae (fimA) é um dos principais componentes da superfície celular da Porphyromonas gingivalis, que desempenha um papel importante na colonização e progressão da doença periodontal (4) , (5). O objectivo do estudo foi identificar a detecção de Porphyromonas gingivalis (fimA), Porphyromonas gingivalis, Prevotella Tanerella Forsythia e nigrescens na placa aterosclerótica dos pacientes com doença arterial coronária (DAC) através da utilização de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR).
Material e métodos
População do estudo
Dos 150 pacientes recrutados, 51 pacientes (11 mulheres e 40 homens) com periodontite crônica na faixa etária de 40 a 80 anos, que preencheram os critérios de inclusão, foram selecionados para o estudo. Esses pacientes apresentavam Doença Arterial Coronariana (DAC), sem outras complicações sistêmicas. Os sujeitos foram programados para serem submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM). Os critérios de exclusão incluíram doença sistêmica importante, malignidade avançada, ingestão de antibióticos e tratamento periodontal nos 6 meses anteriores.
A história médica e odontológica de cada sujeito foi obtida por meio de entrevista. Pacientes que preencheram os critérios de inclusão foram informados sobre o estudo e consentimento foi obtido a partir deles. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Missão Médica de Madras.
Método de Coleta
Amostra de placa subgengival
As amostras foram colhidas no dia anterior à realização da revascularização do miocárdio. Os sítios periodontais mais profundos com profundidade de sondagem ≥ 5 mm foram selecionados para a amostragem microbiana. Os dentes foram gentilmente secos com cotonetes estéreis. Após a remoção da placa supragengival, as amostras da placa subgengival foram obtidas com a ajuda de cureta dos dois locais de periodontite mais profundos e foram reunidas para análise.
Amostra de placa aterosclerótica
Uma biópsia foi obtida da placa aterosclerótica coronariana durante a revascularização do miocárdio. O cirurgião extirpou um ou dois pequenos pedaços de placa (0,5 a 1 mm) da borda da arteriotomia coronariana que foi realizada para anastomisar o enxerto. A extração de DNA da placa subgengival e das amostras de placa aterosclerótica coronariana foi realizada de acordo com Saiki et al, 1988 (6) .
Amplificação por
PCR A amplificação por PCR de rRNA 16S foi realizada para detectar a presença dos microrganismos. Os iniciadores de PCR foram desenhados de acordo com Larsen et al, (1993) (7) (Tabela / Fig. 2) .
A PCR foi realizada conforme descrito por Saiki et al (1988) (6). 10 do molde de ADN da amostra foram adicionados a 40 da mistura de reaco de trabalho de trabalho contendo 5 de tamp de PCR 10x, 1,25 unidades de Polimerase de ADN Taq (0,4), 0,2 mM (1) de cada desoxirribonucleidos (dNTP's ), Primers (1 µl) para frente e (1 µl) reverso dos microorganismos específicos e 31,6 µl de água milli Q. A reaco de PCR foi realizada utilizando um termociclador de PCR da Applied Bio-systems, (EUA). O perfil de temperatura da PCR para Tannerella forsythia e Porphyromonas gingivalis incluiu uma desnaturação inicial de 95 ° C por 2 minutos, seguido por 36 ciclos da etapa de desnaturação a 95 ° C por 30 segundos, a etapa de anelamento a 60 ° C por 1 minuto, extensão a 72 durante 1 minuto e o passo final a 72 durante 2 minutos. (7)O perfil de temperatura para Porphyromonas gingivalis (gene fimA) (WUYan-min et al 2000) (8) incluiu desnaturação inicial a 94 ° C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 1 minuto, anelamento a 50 Durante 1 minuto, extensão a 72 ° C durante 1,5 minutos e o passo final a 72 ° C durante 7 minutos. O perfil de temperatura para Prevotella nigrescens incluiu desnaturação inicial a 95 ° C por 2 minutos, seguido por 36 ciclos, desnaturação a 94 ° C por 30 segundos, anelamento a 55 ° C por 1 minuto, extensão a 72 ° C por 2 minutos e passo final a 72 durante 10 minutos (9) .
Ap amplificao, 10 da aluota do produto de PCR amplificado foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 0,75% contendo 0,5 / mL-1 de brometo de etio em tamp 1XTAE. O gel foi fotografado sob 300 nm usando um transiluminador de luz ultravioleta. Os produtos amplificados por PCR foram sequenciados num sequenciador automático (Genetic analyzer 3130, Applied Bio Systems, EUA). Os dados do sequenciador foram divulgados com os dados disponíveis no banco de genes e foram comparados para possíveis homologias.
Análise estatística
As medidas Kappa de concordância foram aplicadas para descobrir os microrganismos que estavam presentes nas placas subgengival e aterosclerótica, e o valor de P e a porcentagem de prevalência foram calculados.
Resultados
As medidas de concordância Kappa indicaram que existe uma boa concordância da probabilidade da presença de bactérias orais entre a placa subgengival e a placa aterosclerótica dos pacientes, o que significa que os pacientes que estavam abrigando microorganismos na placa subgingval oral teriam chances de sua presença na placa aterosclerótica também (e vice-versa), contribuindo assim para a progressão da aterosclerose.
Discussão
O presente estudo teve como objetivo investigar e comparar a presença de DNA bacteriano oral nas placas subgengival e aterosclerótica dos mesmos pacientes submetidos à revascularização do miocárdio. Tanto a placa subgengival como as amostras de placa aterosclerótica coronária revelaram pelo menos um ADN bacteriano alvo.
A forsítia de tannerela é um anaeróbio Gram-negativo obrigatório que produz várias enzimas proteolíticas que são capazes de destruir imunoglobulinas e fatores do sistema do complemento e, assim, induzir a morte celular apoptótica (10) . Nosso estudo revelou a presença de T.forsythia em 31,4% das amostras de placa aterosclerótica. Essa bactéria também foi detectada em 19,6% das placas subgengival e coronariana, o que está de acordo com os achados de Haraszthy et al (11) , Zaremba e cols.(12) , Ford et al (13) , Gotsman et al (14) , Zhong et al (15) , Yuan-ming et al (16) e Ishihara et al (17) , indicando o papel do microrganismo em contribuir para a progressão da aterosclerose.
Porphyromonas gingivalis pertence ao gênero Bacteroides e é uma bactéria patogênica anaeróbica, não-móvel, gram-negativa, em forma de bastonete. Forma colônias negras em ágar sangue (18)P.gingivalis foi detectado em 45,1% das amostras de placa aterosclerótica. Tanto na amostra subgengival como na placa coronariana, a bactéria foi detectada em 39,2% dos pacientes, mostrando uma correlação significativa entre ambas as placas. Esse é um achado importante, desviante dos achados de Nakano et al (2006) (19), que detectaram apenas 7,4% dos microrganismos da placa coronariana.
Pode-se sugerir que a presença de P. gingivalis tem um papel potencial no início da aterosclerose pela ativação das células fagocitárias, a elevação dos níveis séricos de lipídios, a função prejudicada dos leucócitos polimorfonucleares e a indução da proteína atrativa de monócitos. 1 P. gingivalis afeta a produção de citocinas (prostaglandina E2, interleucina-1β e fator de necrose tumoral-alfa), níveis de proteína C-reativa, acúmulo de lipídios e produção de anticorpos contra proteínas bacterianas de choque térmico. Além disso, o P.gingivalis induz a agregação plaquetária e a produção de metaloproteinases da matriz (20).
O estudo também detectou a presença de P. gingivalis (fimA) em 39,2% das amostras de placa aterosclerótica e 33,3% de ambas as amostras subgengivais e de placa coronariana. Nossos achados corroboram os do estudo animal conduzido por Chou et al, (21) que demonstraram que a invasão mediada por fimbria por P. gingivalis aumenta a expressão gênica inflamatória em HAEC (Células Endoteliais da Aorta Humana) e em tecidos da aorta. Porphyromonas gingivalis é um dos principais fatores causadores da doença periodontal e suas fímbrias (fimA). Os componentes filamentosos localizados na superfície da célula desempenham um papel vital na colonização das bactérias e na invasão dos tecidos periodontais (22) .
Da mesma forma, o P.nigrescens foi detectado em 21,6% das placas ateroscleróticas e em 15,7% das amostras de placa subgengival e aterosclerótica. Embora a prevalência percentual de P. nigrescens tenha sido menor em relação aos demais microrganismos, este microorganismo ainda apresentou associação significativa entre as duas amostras. A detecção de P.nigrescens na placa coronariana é um achado importante deste estudo, uma vez que este estudo é um dos poucos estudos recentes no passado que detectaram a presença desse microrganismo.
Vários mecanismos possíveis podem operar independentemente ou em conjunto para explicar a associação entre infecções orais e aterosclerose. No entanto, evidências sugerem o efeito direto de agentes infecciosos orais na formação de ateroma. Os estudos feitos por Haraszthy (11)e Chiu B (3) sugerem a presença de P. gingivalis em ateromas coronários. As descobertas de Deshpande e colegas (23) mostraram a invasão e proliferação de P. gingivalis em células endoteliais. A principal evidência vem dos estudos de Hersberg e Meyer (24)que mostrou que P. gingivalis é capaz de induzir a agregação das plaquetas, que se pensa estar associada à formação de trombos. A produção de protease por P. gingivalis e outros patógenos periodontais pode contribuir para o remodelamento da matriz extracelular em placas coronarianas. Os achados acima poderiam relacionar que as bactérias orais que infectam as placas coronarianas poderiam contribuir para sua formação ou para os eventos trombóticos associados ao infarto do miocárdio (24) .
Nosso estudo confirma a presença de P. gingivalis (fimA), P.Gingivalis, P.nigrescens e T.forsythia nas amostras de placa aterosclerótica coronariana. É possível que múltiplas bactérias orais possam interagir umas com as outras e com as células vasculares do hospedeiro, direta ou indiretamente, e desempenhar um papel na iniciação, desenvolvimento e progressão da aterosclerose. Esta observação pode fornecer uma base para futuras pesquisas sobre infecções orais e aterosclerose. Isso também pode ajudar a conceber estratégias de tratamento preventivo, como profilaxia oral primária para reduzir o risco de doença coronariana.
Reconhecimento
Agradecemos ao Dr. John Felix por sua análise estatística dos dados compilados.
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